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WS_T 805-2022 临床微生物检验基本技术标准

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ICS
11.020
CCS
C 50
WS
中华人民共和国卫生行业标准
WS/T 8052022
临床微生物检验基本技术标准
Basic technical standard for clinical microbiology laboratory
2023 - 05 - 01 实施
中华人民共和国国家卫生健康委员 发 布
WS/T 8052022
I
目 次
前言 ................................................................................. II
1 范围 ............................................................................... 1
2 规范性引用文件 ..................................................................... 1
3 术语和定义 ......................................................................... 1
4 无菌操作及消毒灭菌技术要求 ......................................................... 2
5 标本处理及制片技术要求 ............................................................. 3
6 染色技术要 ....................................................................... 4
7 显微镜检查技术要求 ................................................................. 4
8 接种技术要 ....................................................................... 5
9 培养技术要 ....................................................................... 7
10 鉴定技术要 ...................................................................... 8
11 分子检测技术要求 ................................................................. 11
12 免疫学检测技术要求 ............................................................... 12
13 质量保证 ......................................................................... 12
参考文献 ............................................................................. 15
WS/T 8052022
II
前 言
本标准由国家卫生健康标准委员会临床检验标准专业委员会负责技术审查和技术咨询,由国家卫
健康委医疗管理服务指导中心负责协调性和格式审查,国家卫生健康委医政司负责业务管理、法规
负责统筹管理。
本标准起草单位:华中科技大学同济医学院附属同济医院、中国人民解放军总医院、北京医院/
家卫生健康委临床检验中心、中国医学科学院北京协和医院、北京大学人民医院、安徽省立医院。
本标准主要起草人:沈定霞、孙自镛、胡继红、徐英春、胡云建、王辉、马筱玲、简翠。
WS/T 8052022
1
临床微生物检验基本技术标准
1 范围
本标准规定了医学实验室在临床微生物检验领域的基本技术要求。
本标准适用于开展临床微生物检验的医学实验室。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款中,注日期的引用文件,
仅该日期对应的版本适用于本标准;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于
标准。
GB 19489 实验室生物安全通用要
WS/T 442 临床实验室生物安全指
WS/T 639 抗菌药物敏感性试验的技术要求
WS/T 497 侵袭性真菌病临床实验室诊断操作指南
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。
3.1
消毒 disinfection
杀灭或清除物体上活的病原微生物的方法。
3.2
灭菌 sterilization
杀灭物体上所有微生物(包括细菌芽胞在内的全部病原微生物和非病原微生物)的方法。
3.3
无菌 asepsis
指不存在活菌。
3.4
无菌操作 aseptic operation
防止微生物进入人体或无菌物品、无菌区域的操作。
3.5
接种 inoculation
将目标微生物转移至适于生长繁殖的人工培养基或活的生物体内的方法
3.6
荧光淬灭 fluorescence quenching
指由于荧光分子与其他分子发生作用而出现的光度降低、发光时间缩短乃至停止发光的现象
3.7
WS/T 8052022
2
一套血培养 a set of blood culture
从同一个穿刺点采集的血液,通常分别注入一个需氧血培养瓶和一个厌氧血培养瓶进行血培养。
3.8
微生物培养 microbial culture
利用人工培养基和适宜的培养条件(如温度、气体环境等),使微生物生长繁殖的技术。
3.9
细菌鉴定 identification of bacteria
以细菌系统分类学为原则,通过一系列的方法,将未知细菌归到一定种属的过程。
4 无菌操作及消毒灭菌技术要求
4.1 无菌操作技术要求
对各类标本进行采集、接种等过程及对已生长的微生物进行血清凝集、鉴定和药敏试验等操作时
要进行无菌操作。无菌操作技术要求包括:
a) 接触培养标本的所有器材必须经过灭菌处理;
b) 稀释标本或制备菌液的液体必须经过灭菌处理;
c) 用于微生物培养的各类培养基在使用前应保证无菌生长
d) 接种标本或转种菌株应将接种()热灭菌,或使用一次性无菌接种环(针);
e) 打开容器挑取标本或培养物后,应尽快盖回盖子,防止他们被污染或造成交叉污染;
f) 用加样器和吸头从试管中吸取体液标本或菌液时,应注意加样器勿接触管壁。
4.2 消毒灭菌技术要求
临床微生物实验室常用的消毒与灭菌技术及要求见表1
1 临床微生物实验室常用的消毒与灭菌技术及要求
待消毒灭菌对象
化学法消毒与灭菌技术
物理法消毒与灭菌技术
工作台面和地面
一般采用含有效氯 400 mg/L700 mg/L 的消毒液,
作用 30 min
经血传播病原体、结核分枝杆菌等,采用含有效氯
2000 mg/L 的消毒液,作用>60 min
紫外灯辐照强度应不低于 70 µW/cm2,安装
紫外灯的数量≥1.5 W/m330
min
实验室空气
无人状态下:
13%过氧化氢,或 5000 mg/L 过氧乙酸,或 500
mg/L 二氧化氯等喷雾;
215%过氧乙酸水溶液7 mL/m3或二氧化氯10
mg/m320 mg/m3)或臭氧(20 mg/m3)熏蒸。
无人状态下,紫外灯消毒:紫外灯辐照强
度应不低于 70 µW/cm2,安装紫外灯的数量
1.5 W/m3,照射时间≥30 min。有人状态
下,采用循环风紫外线空气消毒器或静电
吸附式空气消毒器,遵循产品使用说明。
仪器表面、内壁
70%酒精擦拭(适用时)。
/
玻璃器材
玻璃器材用含有效氯 1000 mg/L 的含氯消毒剂或
70%酒精浸泡后清水冲洗,3遍蒸馏水,干燥后
包装高压。
高压蒸汽灭菌:121 15 min30 min
配制的培养基
/
大部分培养基经 121 15 min 高压蒸汽
灭菌,含葡萄糖培养基 115 15 minXLD
培养基经煮沸 10 minSS 培养基煮沸 1
min2 min
显色培养基 100 15 min
检测后标本
/
高压蒸汽灭菌 121 20 min
培养物
/
高压蒸汽灭菌 121 20 min
WS/T 8052022
3
5 标本处理及制片技术要求
5.1 标本处理的技术要求
微生物实验室根据标本类型、性状以及目标微生物种类进行标本处理的技术要求见2
2 微生物标本处理的技术要求
标本处理
技术要求
离心
对肉眼所见清亮的体液标本,使用普通离心机离心后取沉淀进行接种及涂片;对脑脊液涂片标本宜使
用细胞离心机(1500 g2500 g,15 min)进行甩片离心;进行结核分枝杆菌培养的脑脊液标本量建议
至少在5 mL以上。
剪切
进行毛霉目真菌培养的标本,用无菌剪刀或手术刀片将组织剪成碎条状、块状或团状。
研磨
对块状组织标本,用无菌组织研磨器或研钵和杵,加入适量的生理盐水或营养肉汤进行研磨。研磨后
的组织浆液用于接种及涂片。
去污染
对可能存在目标菌之外的污染菌的标本,进行去污染处理。如从痰标本中分离军团菌可采用KCL-HCL
冲液 (pH2.2)对痰标本进行1:10稀释,室温放置4 min后进行接种;分离厌氧菌(如产气荚膜梭菌或艰
难梭菌),可采用与标本等量的无水(或95%)乙醇混合标本,室温(25 ℃)放置1 h,或采用80
加热10 min后,接种至厌氧培养基。
液化
对黏稠痰,用消化液分散黏液成份。如对痰标本中的结核分枝杆菌,可采用N-乙酰-L-半胱氨酸NALC
2%~4 NaOH,作用一定时间后进行涂片及接种。
5.2 制片的技术要求
5.2.1 制片的种类与技术要求
制片宜在生物安全柜内进行并尽可能使其自然干燥,不建议加热干燥,若采用烤片机,温度宜控制
60 ℃以下。用于检查分枝杆菌的涂片必须在Ⅱ级生物安全柜内进行。制片的种类与技术要求见表3
3 制片的种类与技术要
种类
技术要求
涂片
用拭子或接种环取干酪样、脓性或血性痰均匀涂抹于玻片上;或用滴管吸取穿刺液、脓液滴到载玻片中央,
使其均匀涂抹开;也可将采取了标本的拭子在玻片上轻柔滚动;也可用接种环取菌落在滴有生理盐水的载玻
片上研磨。制备涂片要注意:1避免标本因留置时间过长导致杂菌过多或致病菌溶解;2避免采用陈旧培
养物影响革兰染色的染色性;3)所形成涂膜的大小通常1 cm×2 cm,厚度以透过涂膜能辨认报纸上的文字
为宜。
悬滴
显微镜检查有鞭毛的细菌时,可采用滴管吸取粪便标本直接滴到载玻片上;或将在碱性蛋白胨水增菌培养后
的培养物滴到载玻片上。
粘片
对丝状真菌菌落,采用胶带粘性面粘取真菌菌落,然后将胶带置于已滴加乳酸酚棉蓝染液的载玻片上,用以
保持真菌特征性结构的原始位置。
压片
对浓稠或颗粒状标本,要先将其放到载玻片上,再用另一张载玻片放其上,两张载玻片对压后分开,两张载
玻片接触标本的一面均可作为压片标本。
印片
大块组织标本要先用无菌刀片切(或用无菌剪刀剪)成小组织块,再用镊子取组织放到玻片上,稍加用力使
组织在载玻片上形成印迹,去掉组织块。
5.2.2 固定
为了使标本贴紧载玻片,需进行固定,防止染色过程中脱落。可 用加热固定或使用甲醇固定。
热固定时,载玻片要迅速通过酒精灯的外焰,来回3次;利用电热灭菌器固定时,不要将载玻片紧贴电
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4
热灭菌器,时间不宜超10 s采用甲醇固定时,无水甲醇覆盖在已加有标本的载玻片上,待其挥发
干后即可使用。
6 染色技术要
微生物实验室常用的染色方法、技术要求及质量控制见表4
4 常用微生物染色方法、技术要求及质量控
染色方法
技术要求
质量控制
革兰染色
1染色与脱色时间不宜过长或过短,以免影响染色结果;
2)不推荐对鼻拭子、咽拭子等拭子标本及血标本直接进
行涂片染色,导管不宜涂片染色。
金黄色葡萄球菌ATCC 25923或已知革
兰阳性菌染成紫蓝色,大肠埃希菌ATCC
25922)或已知革兰阴性菌染成粉红色。
抗酸染色
1采用石炭酸复红染色时,推荐加热染色,时间为 5 min
如采取不加热染色,时间宜不低于 15 min
2)血液及导管不宜进行抗酸染色。
龟分枝杆菌ATCC 93326或已灭活分枝
杆菌或已知抗酸杆菌染成红色。
弱抗酸染色
采用“1%~2%硫酸水溶液脱色 1 min2 min 代替抗酸
染色中的“3%盐酸酒精脱色 2 min”。
诺卡菌或马红球菌属或戈登菌属或冢村
菌属标准菌株(或质控菌株或已知弱抗酸
染色细菌)染成红色。
荧光
染色
金胺(O)
1)使用金胺(O)染色的时间为 15 min
2)在暗室中镜检。
分枝杆菌标准菌株(或质控菌株或已知分
枝杆菌)呈橙黄色荧光。
真菌荧光染
真菌荧光染色的时间一般数秒即可,但对于指甲等厚硬组
织及黏稠标本,需先经 1030 KOH 消化,再加入荧
光染色液,可适当延长染色时间。
黑曲霉菌孢子和菌丝呈蓝绿色荧光(视荧
光染液不同而不同)。
墨汁染色
1)墨汁与脑脊液标本的比例以 1:1 1:2为宜;
2)加盖玻片应轻放以防止气泡产生,影响观察。
新型隐球菌具有厚荚膜,并可见芽生细
胞。
六胺银染色
1)玻片处理:甲醇固定后,自然风干,1过碘酸滴染
10 min,流水冲洗;
2)银染 1 h1.5 h,通常念珠菌染色 1 h 即可,疑为曲
霉菌或其他丝状真菌须适当延长染色时间(银染试剂现用
现配,只用一次)。
根据 ATCC 90028 白念珠菌着色(棕黑色)
的深浅调整染色时间。
乳酸酚棉蓝染色
1待检物在乳酸酚棉蓝染液中应静置 5 min以使真菌菌
丝及孢子着色;
2)对于透明菌丝的丝状真菌,采用 75酒精进行适当稀
释可以更清晰看到产孢结构和孢子排列方式。
黑曲霉菌具有孢子和菌丝的形态,染成蓝
色。
注:使用商品化染液应遵循产品说明书。
7 显微镜检查技术要求
7.1 普通光学显微镜检查的技术要求
7.1.1 革兰染色标本的镜检要求
在进行革兰染色标本观察时,需要注意:
a) 在油镜下观察菌体形态、排列、染色性,以及细菌是否在白细胞内或白细胞周围;
b) 将血液及脑脊液培养阳性标本革兰染色镜检结果作为危急值报告;对于痰及气管抽吸物标本
根据低倍镜下鳞状上皮细胞数量及白细胞数量判断是否合格;未离心尿液中,若每个油镜视野看到1
细菌,相当于尿液细菌计数105
/mL生殖道标本若见到革兰阴性双球菌宜报告其是否位于中性粒细
内;
c) 若在低倍镜下发现真菌菌丝或孢子,应转换至高倍镜或油镜确认
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5
7.1.2 抗酸及弱抗酸染色标本的镜检要求
在观察抗酸染色及弱抗酸染色标本时,需要做到:
a) 观察抗酸染色标本时,要将玻片按一定方向及顺序移动,做到不漏检、不重复。连续观察300
个油镜视野未发现抗酸杆菌,方可报告抗酸染色阴性;
b)观察弱抗酸染色标本时,应注意尽可能全范围、多视野进行观察,并注意菌体的形态和排列。
7.1.3 墨汁染色标本的镜检要求
在低倍镜下寻找有荚膜的酵母细胞找到后,转换至高倍镜下确认。具有宽厚荚膜且伴有或不伴有
出芽者为隐球菌,脑脊液中发现隐球菌需按危急值报告。治疗后菌体减少,荚膜变薄,要注意识别。
7.1.4 乳酸酚棉蓝染色标本的镜检要求
观察真菌菌丝孢子的形态,以及菌丝与孢子的关系。注意培养基种类和丝状真菌的培养时间会影
响孢子的形成。
7.1.5 不染色标本的镜检要求
对不染色标本的显微镜检查,需要注意:
a)经阴道采样制作的湿片:注意观察白细胞、黏附细菌的鳞状上皮细胞、酵母菌和阴道滴虫等;
bKOH湿片:注意观察真菌结构,如酵母细胞、菌丝和横隔等
7.2 荧光显微镜检查的技术要求
荧光显微镜主要用于观察没有自发荧光、经荧光染色后能发出荧光的病原体。荧光染色后的标本
尽快观察,避免荧光淬灭对观察结果的影响;用油镜观察标本时,采用无荧光的特殊镜油;可在高倍
(物镜40倍,目镜10倍)观察涂片,至少连续观察50个视野未发现抗酸杆菌方可报告荧光染色抗酸杆
菌阴性;荧光染色观察真菌时,应注意具有不同荧光颜色和荧光强度的真菌孢子和菌丝。
7.3 暗视野显微镜检查的技术要求
在暗室内进行暗视野显微镜的观察如无暗室,应尽可能使用遮光装置,以阻止目镜周围的光线射
入。若视场中样品与背景明暗反差不强可调节聚光器的位置以提高照明光源的照明强度。在暗视野
微镜下观察到运动活泼、呈穿梭状或流星状运动的细菌,应用O1群及O139群霍乱弧菌凝集血清分别
动试验。暗视野显微镜下观察梅毒螺旋体时,应注意寻找细长、两端尖锐、弹簧或螺旋状、折光强的
体,并注意其是否沿纵轴旋转并可前后运动。
8 接种技术要
8.1 微生物不同接种方式的技术要求
微生物不同接种方式的技术要求见表5
5 微生物不同接种方式的技术要求
接种方式
技术要求
平板划线法
分三区(或四区)划线,后面一区划线的起始处与前一划线有所重叠,以获得单个菌落。平板
划线时,平板宜适当倾斜,防止空气或环境微生物落入平板。
平板涂布法
用玻璃棒(或棉签)将一定量的菌液均匀密涂于平板培养基表面。
平板倾注法
先将培养基溶化并冷却至 45 ℃~50 ℃,再加入一定量标本,混匀后倾入灭菌空平板内,待凝
固后放入孵箱进行培养。
点种法
将标本或菌种采用单点或多点接种至平板或斜面培养基表面。同一块平板上仅点种来自同一患
者的标本。
穿刺法
穿刺时,接种针伸入半固体培养基,但不要触到管底。
斜面接种法
接种针穿刺至下层时勿触及管底,在斜面上接种时作蛇形划线。
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6
5 微生物不同接种方式的技术要求(续
接种方式
技术要求
液体接种法
接种至液体培养基或血培养瓶的标本要与培养液混匀。
滚动接种法
将静脉导管在血平板上来回滚动 4次。
自动化接种仪法
采用自动化接种仪进行接种时,需提前对痰、粪便等黏稠标本进行液化处理;导管、组织块及低
于接种仪器取得量的脑脊液等液体标本不宜进行自动化接种。
8.2 微生物接种通用的技术要求
接种临床送检的微生物标本时,应做到:
a)临床微生物标本接种应在二级生物安全柜中进行(参见GB 19489WS/T 442)。标本接种过
要注意无菌操作,避免培养基受到环境微生物污染;
b)实验室收到标本后应尽快接种。如果不能及时接种,应根据所培养的目标细菌选择合适的标
存储条件,或在收集标本时,选用适当的转运培养基。避免延迟接种导致的细菌自溶或死亡,避免污
菌过度生长掩盖致病菌,避免因标本存储不当而降低培养阳性率。
8.3 初次分离用培养基的选择及接种的技术要
针对微生物检测项目和标本类型,应适当选择初次分离用的培养基种类,接种的技术要求见6
6 不同送检项目和标本类型所需的培养基种类与接种的技术要求
项目
标本
选择培养基种类
接种的技术要求
细菌需氧培养
尿液
AB
进行定量培养的尿液标本需要接种至血平
板(见 9.2.1)。
呼吸道标本
ABC+
对痰、气管及支气管吸取物分区划线至平板
培养基;对支气管肺泡灌洗液宜进行定量接
种培养(见 9.2.2)。
粪便
常规:ABSS 平板/XLD 平板;
根据目标致病菌选用液相增菌培
养基。
划线法接种至常规培养基;按液体接种法接
种至液相增菌培养基,增菌后再用划线法转
种至相应固相培养基。
血液
血培养瓶,儿童患者需采用儿童
瓶。
每个穿刺点进行一套血培养;宜从不同穿刺
点进行至少两套血培养。建议每个血培养瓶
接种 8 mL10 mL 血液,儿童血培养的接种
量宜遵循儿童采血规范。
脑脊液
A, C,脑心浸液或血培养瓶。
离心,取沉淀进行接种。若无脑心浸液肉汤,
可接种血培养瓶。
体液(胸水、腹水、
心包积液、关节液)
AC,增菌肉汤或血培养瓶。
若直接接种血培养瓶,建议接种 8 mL10
mL
组织
ABC,增菌肉汤。
组织经研磨后取匀浆接种。难以研磨者可经
超声处理后接种。
腹透液
ABC
50 mL 腹透液,离心后用沉渣进行接种。
导管
A
导管长度 5 cm,在血平板上来回滚动 4次。
生殖道标本
ABC
分区划线以获得单个菌落。
淋病奈瑟菌培养
生殖道标本
C+
分区划线以获得单个菌落。
厌氧菌培养
脓肿穿刺液、膀胱穿
刺尿等
A,厌氧血平板。
分区划线以获得单个菌落。需氧及厌氧血平
板分别放于需氧和厌氧环境培养。
厌氧放线菌培养
痰、组织、穿刺液等
诺卡菌培养
阴道拭子、直肠拭子
A,无乳链球菌显色平板, 选择性
增菌肉汤。
平板划线法,液体接种法。
艰难梭菌培养
粪便
CCFA 或艰难梭菌显色培养基。
在培养基中添加抗菌素或将粪便标本与等
量无水乙醇混匀以去除粪便中的杂菌。
霍乱弧菌培养
水样或米泔样粪便
碱性蛋白胨水,TCBS 培养基。
将粪便标本按液体接种法接种至碱性蛋白
胨水;或按划线法接种至 TCBS 培养基。
WS/T 8052022
7
6 不同送检项目和标本类型所需的培养基种类与接种的技术要求续)
项目
标本
选择培养基种类
接种的技术要求
无乳链球菌培养
阴道拭子、直肠拭子
A,无乳链球菌显色平板。
分区划线以获得单个菌落。
真菌培养
呼吸道标本、尿液等
含抗生素的沙保弱平板或斜面,
珠菌显色培养板(可选)。
需要较长时间培养时,接种沙保弱斜面培养
基。
脑脊液、胸水、腹水
D,含抗生素的脑心浸液,念珠菌
显色培养板(可选)真菌培养瓶。
注入真菌培养瓶或离心后取沉淀进行接种。
组织
D
将组织剪切或研磨后点种。如怀疑为毛霉目
真菌感染时,不宜研磨。
毛发、皮肤、甲标本
含抗生素的沙保弱平板。
直接点种沙保弱平板。
血液
需氧血培养瓶或真菌血培养瓶。
从不同穿刺点采样,分别注入 2个需氧血培
养瓶,或 2个真菌血培养瓶,每瓶采集 8 mL
10 mL 血液。
分枝杆菌培养
痰、尿液、脑脊液等
分枝杆菌液体培养基,罗氏固体培
养基。
标本经处理(液化、离心、去污染)后接种。
血液
分枝杆菌血培养瓶。
将抽取的血液注入分枝杆菌血培养瓶。
注:A:血平板;B:中国蓝/康凯平板;C:不加万古霉素巧克力平板;C+:加万古霉素巧克力平板;D:含或不含抗
生素的沙保弱平板或斜面;CCFA:环丝氨酸头孢西丁果糖琼脂平板;TCBS:硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂平板。
9 培养技术要
9.1 微生物主要培养方式的技术要求
针对微生物的主要培养方式,技术要求(营养条件、气体环境、培养温度、培养时间等)见7
7 微生物主要培养方式的技术要求1
培养方式
技术要求
营养条件(培养基)
气体环境 2
培养温度3
培养时间4
质控菌株5
需氧菌培养
各种营养培养基(血
平板、巧克力平板)
肉汤(脑心浸液)等。
空气,5%~10
CO2气体。
35 ±2
18 h48 h
肺炎链球菌
血性) ATCC 49619
化脓链球菌(β 溶
血性)ATCC 19615
苛养菌培养
各种营养培养基(血
平板、巧克力平板)
5%~10 CO2
体。
35 ±2
18 h48 h
肺炎链球菌 ATCC
49619(血平板);流
感嗜血杆菌 ATCC
49766(巧克力平
)
厌氧菌培养6
厌氧血平板、厌氧菌
选择培养基。
5 CO210 H2
85 N2混合气体。
35 ±2
48 h72 h
溶组织梭菌 ATCC
19401 或产气荚膜
梭菌 ATCC 13124
微需氧菌培养
专用血平板、肉汤
等。
5 O210 CO2
85 N2混合气体。
35 ±2 ,
42
48 h72 h
幽门螺杆菌 ATCC
43504
分枝杆菌培养
罗氏固体培养基、
枝杆菌液体培养基。
空气。
35 ±2
3 d8 w
卡介苗(BCG)菌株
堪萨斯分枝杆
菌。
真菌培养
酵母样真菌培养
35 ±2
2 d14 d
白念珠菌ATCC
14053
丝状真菌培养
真菌小培养
(玻片琼脂块法)
27 ℃±1 ℃,
35 ℃(双相真菌)
2 d14 d
8 w (荚膜组织胞
浆菌)
2 d14 d
烟曲霉菌ATCC
96918
27 ℃±1

标签: #技术

摘要:

ICS11.020CCSC50WS中华人民共和国卫生行业标准WS/T805—2022临床微生物检验基本技术标准Basictechnicalstandardforclinicalmicrobiologylaboratory2022-11-02发布2023-05-01实施中华人民共和国国家卫生健康委员会发布WS/T805—2022I目次前言.................................................................................II1范围................................................

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分类:法规文献 价格:1库币 属性:18 页 大小:623.9KB 格式:PDF 时间:2024-06-05
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